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本制品是包涵体蛋白微量纯化试剂盒的大提升级产品，用于大量、快速的提取高质量的包涵体。

• 大量提取，一次可处理多达5升的菌液，相当于50次中量提取。
  
• 适合制备级别的包涵体纯化，需在50mL以上的离心管或离心瓶中完成。
  
• 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到60%以上。
  
• 本制品主要用于从大肠杆菌宿主中纯化包涵体，也能用于真菌和其他表达系统，但纯化条件（主要是细胞裂解条件）需要自行优化。
  
• 对大肠杆菌宿主，本手册提供高压裂解和酶学裂解两种破碎细菌，超声打断DNA的实验方案。
  
• 得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。

1. 转移1～5L的菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。
   
2. 5000g（相当于Sorvall GSA转头5500rpm）4℃离心15～30分钟，小心弃上清。
   
3. 复称重量，差值就是细菌的湿重。1L的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为3g，所以1～5L菌液一般能得到3～15g细菌。
   
   • 后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。
4. 细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

1. 按每克细菌湿重加入3mL包涵体纯化溶液A重悬细胞，1-5L的菌液得到的细菌沉淀一般是3～15g，故需要加入9～45mL包涵体纯化溶液A。加入后可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过10克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。
   
2. 留少量样品做未裂解对照，剩余得样品通过压力为16000～18000 lb/in2的高压细胞破碎仪裂解，收集的细胞裂解液需放冰上，显微镜下检查裂解前和裂解后完整细菌得数量，反推出裂解细菌的比例。
   
3. 重复上步操作一次或多次，直到在显微镜下观察不到或只能观察到非常少的完整细菌。
   
4. 一般经过多次高压细胞破碎的裂解液不会非常粘稠（DNA被打断）。如果还是非常粘稠，将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理打断DNA，工作状态为50%（开0.5秒，关0.5秒），直到不再粘稠为止。此进行此操作时，最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

5. 按每克细菌湿重加入3mL包涵体纯化溶液A重悬细胞，1-5L的菌液得到的细菌沉淀一般是3～15g，故需要加入9～45mL包涵体纯化溶液A。加入后可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过10克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。
   
6. 在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为120mg/mL（45mL加5.4g），搅拌混匀后37℃放置30分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的DNA将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
   
7. 将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理打断DNA，工作状态为50%（开0.5秒，关0.5秒），一般需要5分钟。具体可以根据溶液粘稠度决定。此进行此操作时，最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

8. 将超声处理后的细胞裂解液转移到离心瓶中，7000g 4℃下高速离心60分钟（转子不同7000g对应的离心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。
   
9. 将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在预冷的包涵体洗涤液中。每克细菌需要5mL包涵体洗涤液，1升细菌的湿重约3克，大约需要15mL，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置5分钟。
   
10. 7000g 4℃下高速离心30分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。
    
11. 重复第9～10步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤2次（共3次洗涤），小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的包涵体洗涤液足够一次5升规模的提取洗3次，如需更多包涵体洗涤液请单独购买。
    
12. 上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占60%重量，其余40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。
    
13. 估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水平，如果表达水平为1%，则1克湿重的细菌中将含有1mg重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在75%，即1mg重组蛋白质能得到0.75mg，丢失0.25mg。

14. 在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。
    
    • 如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入1mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为4～5mg/mL；
      
    • 如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入3mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为1～2mg/mL；
      
    • 包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须45～65℃溶化并混匀后才能使用。
      
    • 包涵体溶解液含6M盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样。客户可用自备的尿素配制8-10M尿素的溶液（尿素溶液不稳定，所以不能长期放置）溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。
15. 室温放置1小时使蛋白质充分溶解。
    
16. 7000g 4℃离心60分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。
    
    • 检查离心管能否承受此离心力。含溶解蛋白的上清脱盐后，可以进行SDS-PAGE电泳，检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
17. 将上清（溶解的包涵体）分成10～20mL一份，放于塑料离心管中（不要超过离心管容量的70%）置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。